Exosomes/Extracellular Vesicles-盟基生物科技股份有限公司

Exosomes/Extracellular Vesicles

Small targets, Big challenges 帶領您ㄧ窺細胞外囊泡的堂奧
(Exosomes/Extracellular Vesicles, EV)

細胞外囊泡(EV)是由細胞分泌的膜結合小顆粒，被認為具有細胞間傳遞訊息的功能：將物質從一個細胞運送到另一個細胞。具多種亞型，其功能、物質和尺寸各不相同，直徑範圍約 30～1000 nm。最小的 EV 類型是外泌體(Exosome)，大小約為 30～150 nm。 EV 起源於稱為多泡體 (MultiVesicular Body, MVB) 的細胞室，其本身源自內體(endosome)的內陷。當 MVB 與細胞質膜融合併釋放其物質時，以囊泡型式被釋放。
在生物醫學研究中，外泌體及其攜帶物質被用作癌症和其他疾病的診斷生物標誌物。 EV 和外泌體可以使用超速離心、PEG 沉澱和免疫磁珠等技術從血液或其他生物體液中分離出來。
外泌體膜含有源自原始細胞質膜的跨膜蛋白，通常包括四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族的蛋白質（如 CD9、CD63 和 CD81）。在內部，外泌體包含蛋白質和RNA等細胞質成分。可以使用 RNAseq、Ｗestern blot和flow cytometry等方法分析其成份。

Extracellular vesicle(EV)。EV的功用就像細胞與細胞間的信件，幾乎所有類型的細胞都會釋放，是一種不能夠複製的脂雙層顆粒，能攜帶大量來自原本細胞的蛋白質、核酸、脂質、代謝物，甚至胞器，種類有Exosomes、Microvesicles和Apoptotic bodies等等。

圖片來源：Wiktoria M. Suchorska and Michal S. Lach: The role of exosomes in tumor progression and metastasis (Review) Oncol Rep. 2016 Mar;35(3):1237-44.

藉由流式細胞分析法，研究人員可以使用針對膜和核酸等外泌體進行染色的螢光染劑，以及與四次跨膜蛋白或其他目標蛋白質結合的抗體。

盟基提供一系列外泌體(Exosome) 流式細胞儀驗證之抗體及胞膜染劑

一、流式細胞儀專用抗體，標定Exosome一管搞定
優勢
1. 所有抗體經實驗驗證
2. 使用單株抗體，具絕佳專一性
3. 搭載CF dye螢光亮度強又穩定
4. 應用Flow cytometry逐一分析，一顆不漏

不同的抗體一樣的精準標定，分析Exosome真easy
實例驗證
利用Flow cytometry先行分選出由MCF-7細胞所衍生exosome，再以不同螢光抗體進行標定。
灰色區域：未標定染色 ; 橘色區域：抗體標定染色。(括弧表示抗體clone來源/名稱。)
標定效果一把罩！

CD9 (1619)	>CD63 (MX-49.129.5)	>Ep-CAM (HEA125)	>CD81 (1.3.3.22)

商品資訊：標定Exosome專用抗體
★ 抗體皆經驗證確認其標定效果 ★

抗體名稱	Clone名稱	Exosome 前處理驗證		染色強度	螢光選擇	備註
		磁珠分選*1	SEC層析純化*2
CD9 (human)	CD9/1619	√	√	+++	高亮度螢光染劑 CF dye 光譜參照如右圖	推薦使用：螢光染色亮度高
	CD9/2343
CD81 (human, mouse, rat)	1.3.3.22
	rC81/3442
rabbit CD81 (human, mouse, rat)	C81/2885R		-	++		效果稍弱於其他CD81抗體
CD63 (human, mouse)	MX-49.129.5			+		可標定經磁珠分選但未純化之exosome
CD63 (human)	LAMP3/968
Ep-CAM (human)	VU-1D9					MCF-7細胞衍生exosome的Ep-CAM蛋白表現低，但仍可標定偵測l
	rVU-1D9
	EGP40/826+ EGP40/837+ EGP40/1110+ EGP40/1120
	HEA125

*1. 利用磁珠(CD63-specific magnetic beads )搭配Flow cytometry先行分選出由MCF-7細胞衍生exosome
*2. 利用SEC層析管柱純化大小相近的MCF-7細胞衍生exosome

二、新型CF® dye螢光染劑，Exosome胞膜染色一級棒
優勢：
1. 螢光強度更高：優於目前市面上Alexa Fluor®等多數染劑
2. 背景值更低：CF® dye 負電荷較 Alexa Fluor®, DyLight®, IRDyes®少。去除染劑非專一性吸附，亦不影響抗體等電點
3. 穩定性更高：長時間照射，活性不減
4. 酸鹼耐受性更高：耐受範圍：pH 2～pH 11

應用：Flow cytometry
實例驗證：CellBrite®染色細胞外囊泡(exosome)

長效型染劑：CellBrite® Steady 405	可染色後固定：CellBrite® Fix 488	可染色後固定：“Highlight”期刊文獻引用

SEC層析MCF-7細胞所衍生的exosome，利用0.02X CellBrite® Steady 405染色(右圖)，相較於僅有緩衝液的對照組(左圖)：可看見特異性染色結果。 *EVs were detected on a CytoFLEX LX flow cytometer in the Pacific Blue channel.	SEC層析MCF-7細胞所衍生的exosome，利用0.5X CellBrite® Fix 555染色(右圖)，相較於僅有緩衝液的對照組(左圖)：可看見exosome特異性染色結果。 *EVs were detected on a CytoFLEX LX flow cytometer in the Pacific Blue channel.	利用CellBrite® Fix 488螢光染劑及rotavirus nucleocapsid抗體針對含有Wa的囊泡進行雙重染色。箭頭所指即為雙重標定的囊泡。

產品資訊：細胞外囊泡/Exosome膜染劑

染劑名稱	SEC層析純化*1	染色強度	已驗證過之螢光選擇	備註
CellBrite® Steady	v (PEG-enriched HeLa-derived EVs)	+++	405, 488, 550, 650, 685	非共價鍵結染劑對磁珠有非專ㄧ結合
MemBrite® Fix 405/430	v (PEG-enriched HeLa-derived EVs)	+++	405/430	以Pacific Blue channe分析共價鍵結可能不適合與抗體進行共染
CellBrite® Fix 488 & 555	v	++	488, 555	以FITC and PE/Cy3 channe分析共價鍵結可能不適合與抗體進行共染文獻參考*3
Di-8-ANEPPS	v	++		以紅色螢光分析非共價鍵結溶解度略低於其他染劑文獻參考*4,5

*1. 利用SEC層析管柱純化大小相近的MCF-7細胞衍生exosome
*2. 利用磁珠(CD63-specific magnetic beads )搭配Flow cytometry先行分選出由MCF-7細胞衍生exosome
*3. Cell Host & Microbe (2018) Aug 8;24(2):208-220.e8 doi: 10.1016/j.chom.2018.07.006
*4. Cytometry A. (2016) Feb;89(2):196-206 doi: 10.1002/cyto.a.22787
*5. Anal. Chem. (2021) 93, 14, 5897–5905 doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00253

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