Exosomes/Extracellular Vesicles-盟基生物科技股份有限公司

Exosomes/Extracellular Vesicles

Small targets, Big challenges 帶領您ㄧ窺細胞外囊泡的堂奧
(Exosomes/Extracellular Vesicles, EV)

細胞外囊泡(EV)是由細胞分泌的膜結合小顆粒，被認為具有細胞間傳遞訊息的功能：將物質從一個細胞運送到另一個細胞。具多種亞型，其功能、物質和尺寸各不相同，直徑範圍約 30～1000 nm。最小的 EV 類型是外泌體(Exosome)，大小約為 30～150 nm。 EV 起源於稱為多泡體 (MultiVesicular Body, MVB) 的細胞室，其本身源自內體(endosome)的內陷。當 MVB 與細胞質膜融合併釋放其物質時，以囊泡型式被釋放。
在生物醫學研究中，外泌體及其攜帶物質被用作癌症和其他疾病的診斷生物標誌物。 EV 和外泌體可以使用超速離心、PEG 沉澱和免疫磁珠等技術從血液或其他生物體液中分離出來。
外泌體膜含有源自原始細胞質膜的跨膜蛋白，通常包括四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族的蛋白質（如 CD9、CD63 和 CD81）。在內部，外泌體包含蛋白質和RNA等細胞質成分。可以使用 RNAseq、Ｗestern blot和flow cytometry等方法分析其成份。

Extracellular vesicle(EV)。EV的功用就像細胞與細胞間的信件，幾乎所有類型的細胞都會釋放，是一種不能夠複製的脂雙層顆粒，能攜帶大量來自原本細胞的蛋白質、核酸、脂質、代謝物，甚至胞器，種類有Exosomes、Microvesicles和Apoptotic bodies等等。

圖片來源：Wiktoria M. Suchorska and Michal S. Lach: The role of exosomes in tumor progression and metastasis (Review) Oncol Rep. 2016 Mar;35(3):1237-44.

藉由流式細胞分析法，研究人員可以使用針對膜和核酸等外泌體進行染色的螢光染劑，以及與四次跨膜蛋白或其他目標蛋白質結合的抗體。

盟基提供一系列外泌體(Exosome) 流式細胞儀驗證之抗體及胞膜染劑

一、染劑
1. ExoBrite™ EV surface staining kits

產品優勢
1. 有 3 種 conjugates probes可選擇 : Annexin V, WGA (wheat germ agglutinin), 及 CTB (Cholera Toxin Subunit B), 皆經過流式細胞儀驗證，以最小的 aggregation 對 EV 表面進行明亮且特異性的染色
2. 專門使用於流式細胞儀檢測細胞外囊泡 (Ev)
3. 經實驗認證可與其他抗體共染色
4. 訊號明亮、背景值低
5. 有 4 種螢光可供選擇
6. 可用於已純化或與 bead-bound 的 Exosome
新型CF® dye螢光染劑，EV染色一級棒！

使用三種不同的 ExoBrite™ 染劑對 SEC 純化的 EV 進行染色：ExoBrite™ 560/585 Annexin Stain, ExoBrite™ 490/515 WGA Stain, and ExoBrite™ 410/450 CTB Stain。

ExoBrite™ EV Membrane Stains 與其他傳統染劑或競品相比具有較少的背景值和更完整的膜染色效果。純化的 EV 分別利用上述不同的染劑進行染色，圖中被框選的區域表示成功被染色的 EV population 數目，數字代表百分比。此外，將每種染劑也添加到過濾後的 PBS 中，藉此確認染劑的 aggregation 和非特異性背景。紅色箭頭表示這些染劑的aggregation。 DiO 等親脂性染劑具有大量與 EV 大小相似的顆粒，因此不適合小顆粒染色。 CellMask™ 也顯示 EV 框選內的染劑有aggregation 。 ExoFlow-ONE™ 和 ExoGlow™ 染劑形成的 aggregation 大部分可與 EV 區分，但與 ExoBrite™ CTB 染劑相比，它們對 EV 的覆蓋也不夠完整。**使用SEC層析管柱從MCF-7 細胞上清液中純化 EV

產品資訊

Product	Conjugate	Detection channels	Ex/Em	Size	Catalog Number
ExoBrite™ Annexin EV Staining Kits	Annexin V	Pacific Blue™	416/452 nm	100 / 500 Labelings	30119-T / 30119
		FITC	490/516 nm	100 / 500 Labelings	30120-T / 30120
		PE	562/584 nm	100 / 500 Labelings	30121-T / 30121
		APC	652/668 nm	100 / 500 Labelings	30122-T / 30122
ExoBrite™ WGA EV Staining Kits	Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Pacific Blue™	416/452 nm	100 / 500 Labelings	30123-T / 30123
		FITC	490/516 nm	100 / 500 Labelings	30124-T / 30124
		PE	562/584 nm	100 / 500 Labelings	30125-T / 30125
		APC	642/663 nm	100 / 500 Labelings	30126-T / 30126
ExoBrite™ CTB EV Staining Kits	Cholera Toxin Subunit B (CTB)	Pacific Blue™	416/452 nm	100 / 500 Labelings	30111-T / 30111
		FITC	490/516 nm	100 / 500 Labelings	30112-T / 30112
		PE	562/584 nm	100 / 500 Labelings	30113-T / 30113
		APC	642/663 nm	100 / 500 Labelings	30114-T / 30114
ExoBrite™ EV Surface Stain Sampler Kit, Green	Annexin V, Wheat Germ Agglutinin (WGA), Cholera Toxin Subunit B (CTB)	FITC	490/516 nm	100 Labelings	30127

2. EexoBrite™ STORM CTB EV staining kits
由於外泌體和 extracellular vesicles 的尺寸極小以及光學顯微鏡解析度的限制，透過影像來區分它們仍是一個挑戰。藉由 stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) 超高解析顯微鏡技術，可突破傳統光學顯微鏡的繞射極限，而 Biotium 的 ExoBrite™ STORM EV Membrane Stains 是專為 STORM 研發用以觀察 EVs 的膜染劑。

產品優勢
1. 深入研究 EV 形態和結構
2. 專為 STORM 影像的優化 CTB conjugates 配方
3. 可與其他 EV biomarkers抗體共同染色及定位研究
4. 有 4 種螢光可供選擇

人類直腸癌細胞衍生的 EV 超解析度 dSTORM 影像。利用anti-CD9/CD63/CD81 cocktail conjugated to CF®647染色 (以洋紅色顯示) 及1X ExoBrite™ 560/585 (以青色顯示) 對 EV 進行染色。 Data was processed using a beta-release version of CODI, ONI’s cloud-based data analysis platform。 Scale bars are 500 nm (zoomed out, left panel) and 50 nm for single-EV panels (right). Image courtesy of ONI.

產品資訊

Product	Ex/Em (nm)	Laser Line(s) (nm)	Detection Channel	Size	Catalog Number
ExoBrite™ STORM CF®505 CTB EV Staining Kit	505/519	488	FITC	100 / 500 Labelings	30115-T / 30115
ExoBrite™ STORM CF®583R CTB EV Staining Kit	583/609	555 or 561	Rhodamine or Texas Red®	100 / 500 Labelings	30116-T / 30116
ExoBrite™ STORM CF®647 CTB EV Staining Kit	652/668	633-640	Cy®5	100 / 500 Labelings	30117-T / 30117
ExoBrite™ STORM CF®680 CTB EV Staining Kit	681/698	633-640	Cy®5.5	100 / 500 Labelings	30118-T / 30118

二、抗體
1. ExoBrite™ flow antibody conjugates
外泌體膜上含有源自原始細胞膜的跨膜蛋白，如CD9 、CD63 和 CD81，可做為篩選標記，以 flow cytometry 來進行分析。
不同的抗體一樣的精準標定，分析Exosome真easy！

產品優勢
1. 專門使用於流式細胞儀檢測 Exosome marker
2. 所有抗體經實驗驗證
3. 訊號明亮、背景值低
4. 同步上市 IgG1 Isotype Control Antibody
5. 有 3 種螢光可供選擇
6. 可用於已純化或與bead-bound 的Exosome

使用ExoBrite™ 560/585 CD63 Flow Antibody 對 SEC層析管柱純化之 MCF-7 細胞所衍生的 EV 進行染色（左圖），與僅有緩衝液的對照組相比（右圖），可以看到特異性染色。
＊ Exosomes were detected on a CytoFLEX LX flow cytometer in the PE channel.

產品資訊

Product	Conjugates	Detection Channels	Sizes	Catalog Number
ExoBrite™ CD9 Flow Antibody	ExoBrite™ 410/450	Pacific Blue ™	25 / 100 tests	P003-410… P003-RPE
ExoBrite™ CD63 Flow Antibody	ExoBrite™ 490/515	FITC	25 / 100 tests	P004-410… P004-RPE
ExoBrite™ CD81 Flow Antibody	ExoBrite™ 560/585	PE	25 / 100 tests	P005-410… P005-RPE
ExoBrite™ IgG1 Isotype Control Flow Antibody	ExoBrite™ R-PE		25 / 100 tests	P008-410… P008-RPE

2. ExoBrite™ western antibody conjugates
ExoBrite™ Western Antibodies 利用 near-IR fluorescent western blot 分析外泌體 extracts 的 marker protein，如CD9 、CD63 和 CD81，提供明亮又低背景值的 data!

產品優勢
1. 專門使用於螢光Western blot 檢測 Exosome marker
2. 所有抗體經實驗驗證
3. 訊號明亮、背景值低
4. 同步上市 ExoBrite™ Calnexin Western Antibody
5. 有 2 種螢光可供選擇

使用ExoBrite™ 680/700 CD9 Western Antibody and ExoBrite™ 770/800 Calnexin Antibody (CANX; EV negative control) 對 MCF-7 細胞及其所衍生的 EV lysates進行Western blot 分析。Lane M: Protein marker. Lane 1: 10 ug cell lysate. Lane 2: 1 ug cell lysate. Lane 3: 1 ug EV lysate。The blots were imaged on a LI-COR Odyssey® infrared imaging system.

產品資訊

Product	Conjugates	Sizes	Catalog Number
ExoBrite™ CD9 Western Antibody	ExoBrite™ 680/700 ExoBrite™ 770/800	25 / 100 tests	P003-680, P003-770
ExoBrite™ CD63 Western Antibody			P004-680, P004-770
ExoBrite™ CD81 Western Antibody			P006-680, P006-770
ExoBrite™ Calnexin Western Antibody	ExoBrite™ 770/800		P007-770

三、磁珠
1. ExoBrite™ streptavidin magnetic beads
使用 ExoBrite™ Streptavidin Magnetic Beads 簡化 isolation EV 及 exosome 的步驟，該磁珠提供比同類產品更低的背景值和更高的靈敏度，且這些 streptavidin-coated 和 magnetic polystyrene beads (直徑 4.5 um)可直接從細胞培養基或其他生物液體中分離 EV，無需過夜沉澱步驟。
分離 EV 及 exosome方便且優化的方法

產品優勢
1. 藉由與 biotinylated antibody (not included) 結合來分離 EV
2. 可直接從細胞培養基或其他生物液體中分離 EV，無需過夜沉澱步驟
3. 與其他品牌相比具有更低的背景值和更高的靈敏度
4. 磁珠分離方便
5. 分離後的 EV可以 microscopy, flow cytometry, 或 western blot檢測

ExoBrite™ Streptavidin Magnetic Beads 分別先與 biotinylated CD9 / CD63 / CD81 antibody incubated (橘色)，然後再與濃縮的 MCF-7 細胞上清液一起 incubated 。使用 ExoBrite™ 560/585 CTB EV Stain 對 EV 進行染色，並透過流式細胞儀的 PE channel 進行檢測。

產品資訊

Product	Sizes	Catalog Number
ExoBrite™ Streptavidin Magnetic Beads	5ml	28000

四、試劑
1. Total Exosome Isolation Reagent

產品優勢
1. 不費時間
2. 無需超速離心
3. 可從細胞培養上清液或生物液中分離外泌體
4. 能夠分離樣本中的整體外泌體群體
5. 可從少量樣本分離外泌體（血漿/血清 100 ul）
6. 對於血漿等複雜生物流體，無需凝血酶預處理
7. 分離的外泌體完好無損，適合不同的下游實驗分析


相較於他牌 T-Pro Total Exosome Isolation Reagent 分離效果較佳。T-Pro Reagent* is T-Pro Total Exosome Isolation Reagent.	將不同體積 (10ml, 5ml and 1ml) 的細胞培養液中分離的 Exosome 利用 CD9 Antibody (abcam) ab236630 及 CD63 Antibody (abcam) ab134045 進行 western blot 檢測。結果顯示，不同體積的培養液皆可有效的分離出 Exosome。 T-Pro reagent* is T-Pro Total Exosome Isolation Reagent (for cell culture media)

產品資訊

Product	Sizes	Catalog Number
T-Pro Total Exosome Isolation Reagent (for cell culture media)	100 ml	JO66-V001S
	500 ml	JO66-V001M
T-Pro Total Exosome Isolation reagent (from serum)	5x1 ml	JO66-V002S
T-Pro Total Exosome Isolation reagent (from serum)	25 ml	JO66-V002M

2. Total exosome RNA isolation kit

產品優勢
1. 專為分離 exosome RNA 所設計
2. 只需約30分鐘就可獲得最大產量的超純 RNA，適合 RNA expression (特別是 miRNA), processing, or function 研究
3. 獲得的 RNA 可用於下游實驗應用，包括 RT PCR、定序 (如 Ion PGM™、IonProton™ 或 SOLiD® 系統), RNA amplification, microarray analyses, solution hybridization assays, and blot hybridization

產品資訊

Product	Sizes	Catalog Number
T-Pro Total Exosome RNA Isolation Kit	50 test/kit	JO67-D001

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