RNAi-客製化抗體-盟基生物科技股份有限公司

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RNAi

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Gene service

RNAi

RNA干擾技術

RNA干擾技術

GenePharma擁有國際領先水準的siRNA化學合成的全部核心技術,包括ssRNA合成、一般與修飾的siRNA oligo合成技術、核酸螢光標記技術、多種核苷酸化學修飾技術、shRNA plasmid建構技術以及Lentiviral vector建構技術等,其RNAi產品為全球主要的供應服務商。目前合成服務已拓展至美國、日本、台灣、新加坡、德國、瑞典、英國、法國、韓國與中國等地區,並與中國清華大學及北京大學等知名院校長期合作。所有貨品均照ISO9000的品質管理進行研發、生產、包裝及儲運。

種類

1. siRNA
(1) 單條合成:
A. 普通siRNA:GenePharma普通的siRNA oligo皆由HPLC純化,100%除去尚未配對的單鏈,價格便宜,品質卓越。
B. 化學修飾siRNA:RNAi技術的最大難題在於化學合成siRNA之穩定性問題。GenePharma所提供的化學修飾stable siRNA,其可於細胞中之作用時間長,比標準的siRNA的作用時間可延長達一倍左右,此外,化學修飾siRNA可有效減少副作用。GenePharma化學修飾stable siRNA不僅增強於血清和細胞培養中之壽命,並加強了於in vivo條件下的應用能力(表一、表二)。

表一 比較普通siRNA與化學修飾siRNA


表二 化學修飾


C. 螢光修飾siRNA:GenePharma可對siRNA末端以多種不同螢光標記物進行標記。標記後的siRNA可利用流式細胞儀、螢光顯微鏡、共聚焦顯微鏡…等觀察以確定轉染效率,優化轉染條件;螢光標記的siRNA還可應用於siRNA細胞內定位及雙標記分析實驗(配合標記抗體)以追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞,將轉染與目標蛋白表達之下游應用結合起來。

D. RNAi對照:GenePharma提供三種RNAi對照:(1) 與目標基因序列無同源性的通用陰性對照 (negative control)和將選中的siRNA序列打亂(scrambled)的陰性對照;(2) 與目標基因序列無同源性的FAM標記的通用陰性對照以及(3) 陽性對照 (positive control)於一個實驗系統是很重要的,當可觀察到siRNA陽性對照的預期實驗結果時,可確保於該實驗方法中,您的轉染試驗、RNA提取物和檢測方法是可靠的(表三)。

表三 陽性對照siRNA


(2) 套餐組合:針對目標基因提供三條siRNA,至少一條保證可達70%以上之抑制率,即可單獨使用又可隨意組合,以「siRNA Pool」形式提高抑制效率。並提供三種對照組(表四)。
表四 siRNA套餐組合內容物


2. miRNA
(1) mimic & inhibitor:mimic為單股miRNA oligo,比起native-based mimic有更佳性能;而inhibitor為甲氧修飾之單股miRNA olligo,使其結構更穩定,兩者皆適用於細胞。此外,原廠提供兩種之library。mimic作為仿效miRNA表現之產品;反之,inhibitor為抑制miRNA表現。
(2) agomir & antagomir:GenePharma依靠領先的核酸化學合成技術,推出miRNA mimics、inhibitor的升級產品:miRNA agomir和antagomir。agomir為通過模擬內源性的miRNA來調節靶基因的生物學功能;antagomir是根據microRNA成熟體序列設計,其用於抑制內源性microRNA的高效阻斷劑 。agomir與antagomir經過特殊標記與化學修飾的單鏈小RNA,轉染效率與穩定性皆比mimic與inhibitor高;干擾效果時間長,最長可持續5-6週;antagomir和agomir與細胞膜親和力更高,細胞轉染實驗之轉染試劑用量顯著減少;此外,更適用於in vivo實驗,可採用全身注射或局部注射等多種方式給藥,操作簡單方便。GenePharma為您提供更經濟的實驗方案,更輕鬆的實驗操作,更完美的實驗結果。

【註】agomir &antagomir之修飾如下:
‧agomir在反義鏈進行修飾:3'端進行膽固醇修飾;5'端兩個硫代骨架修飾 ;3'端四個硫代骨架修飾全鏈甲氧基修飾。
‧antogimir: 3'端進行膽固醇修飾;5'端兩個硫代骨架修飾;3'端四個硫代骨架修飾;全鏈甲氧基修飾。

(3) miRNA expression vector
A. microRNA過度表現載體:GenePharma提供兩種過度表現miRNA之載體建構方式:
1. 從天然的基因組序列中表達pre-miRNA轉錄本建立pre-microRNA。插入序列不僅包含pre-miRNA莖環結構,同時建立100-200bp長的上下游兩端的側翼序列。使用pol-Ⅱ(例如:CMV)啟動子,這種建構方式保證可高水準的表達pre-microRNA。此外,這種建構方式所表達出來的pre-miRNA的生理活動盡可能接近天然狀態。使用這種建構方式,您只需提供miRNA的具體資訊與指定過表達載體類型,GenePharma完成序列合成,質體構建。
2. 利用GenePharma優化過的載體,模擬內源miRNA-155的表達模組,這種構建方法解決了不同miRNA表達效率差異的問題,同時也有效的避免了部分內源性miRNA表達時會產生-3p與-5p的問題。miRNA的髮夾序列融合在EGFP報導基因的後面,模擬miRNA在體內的成熟過程。使用這種建構方式,您只需提供miRNA的具體資訊,GenePharma完成序列合成,質體構建。

GenePharma miRNA載體之特色:
* CMV promoter可高度表現目標基因
* EmGFP利用螢光顯微鏡可觀察轉染效過
* Blasticidin resistance gee可用來篩選穩定細胞株
* Spectinomycin可篩選含有已經轉化質體的E.coli
* 含有pUC origin的質體可於E. coli中進行high copy

B. microRNA抑制子表達載體:GenePharma提供兩種miRNA抑制子之載體建構方式:
1. 利用GenePharma優化過的載體,模擬內源miRNA-155的表達模組,來表達miRNA inhibitor序列。這種構建與GenePharma miRNA過表達方式2使用同樣的載體系統,方便客戶使用同一套系統完成miRNA的過表達與抑制。使用這種構建方式,客戶只需提供miRNA的具體資訊,GenePharma完成序列合成,質體構建。
2. miRNA sponge載體構建:GenePharma通過構建載體,表達包含多個成熟miRNA結合位點的RNA序列,通過吸附結合成熟miRNA,從而抑制miRNA的作用,從而進行功能缺失性研究。使用這種構建方式,客戶需提供miRNA的具體資訊、預構建miRNA inhibitor的重複數及預構建inhibitor的序列資訊,GenePharma完成序列合成,質體構建。

GenePharma miRNA sponge之特色:
* 由於miR Sponges是由質體編碼的,它能夠通過真核表達載體或包裝慢病毒顆粒達到穩定沉默細胞microRNA的目的
* 能夠沉默整個家族的microRNA以達到對整個家族microRNA功能的研究
* 可以利用miR Sponges實現體內外loss of function研究
* 可以用來檢測luciferase目標基因報告系統分析
* 可以自由組合串聯不同miRNA抑制子序列,達到沉默多種不同miRNA的目的

(4) control miRNA:一個完整的實驗設計,皆必須包含對照組,其目的在於監測實驗中的實驗條件與操作是否正確,並可以此對實驗進行優化。分為positive control、negative control以及FAM-labeled negative control。

3. shRNA:shRNA表達載體帶有抗生素標記,可以在細胞中持續抑制目標基因的表達,持續數星期甚至更久。對於一個已知有效的siRNA序列(例如:經過siRNA合成方法篩選獲得的),需要維持較長時間的基因沉默時,推薦使用shRNA載體系統。GenePharma致力於提供最先進和最方便的shRNA相關工具,推出新一代shRNA表達質體,一種高效即用質體,該質體在細胞內可以持續產生shRNAs,進而達到持久抑制目標基因表達之目的。

(1) 單個合成:載體形式好操作,GenePharma提供八種載體可供選擇
表五 shRNA載體選擇


(2) 套餐組合:針對目標基因提供四個shRNA,至少一個保證可達70%以上的抑制率,並提供兩個對照組。
表六 shRNA套餐組合內容物


4. Lemtivirus shRNA:慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質體可提供所有的轉錄並包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為了產生高梯度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質體同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液後,可直接用於宿主細胞的感染,目標基因進入到宿主細胞之後,經過反轉錄,整合至基因組,進而可高水準的表達效應分子。適用於初代培養細胞以及難以轉染的各種細胞,可用於製備多種穩定沉默特定基因的細胞株。

盟基生物科技為GenePharma代理商,若對GenePharma的RNAi有任何疑問,請來電洽詢盟基生物科技或當區業務。盟基生物科技的專業服務團隊提供了研究人員完整的銷售前與銷售後的技術資源,讓您於研究上無後顧之憂。