無病毒中和抗體檢測套組 (sVNT)-客製化抗體-盟基生物科技股份有限公司

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科學新知

新冠病毒中和性抗體檢測新方法:無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT)

新冠病毒中和性抗體檢測新方法:無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT)
操作更安全、更快速、品質更穩定

產品介紹
病毒感染人體後,免疫系統會產生抗體,依據抗體對於病毒的結合方式可分成兩類:Binding antibody (結合性抗體) 和 Neutralizing antibody (中和性抗體)。結合性抗體雖然會結合病毒,但是無法保證能夠抑制病毒感染細胞,反而有可能造成 Antibody-dependent enhancement (ADE),促進病毒感染。而中和性抗體能夠結合病毒辨認細胞的位置,進而抑制病毒感染。(Genscript 亦提供經過檢測後具有中和能力的 anti-Spike 抗體,可直接購買作為抗體藥開發,歡迎來電詢問)
傳統上要檢測 Virus neutralization antibody (VNT) 需要活的病毒,危險性較高,需要 BSL3 實驗室。後來發展的假病毒 (pseudovirus) 危險性較低,但依然需要 BSL2 實驗室。而此套組在一般的實驗室裡操作即可,非常安全,操作也很簡單,品質也更穩定 (表一)。目前市面上的 ELISA 或 lateral flow assay 只能偵測結合性抗體,因此此套組適用於新冠病毒 (2019-nCoV, SARS-CoV-2) 的疫苗開發或抗體藥篩選。此方法已經發表於期刊 Nature Biotechnology,更多資訊請參考完整文獻。
此套組不含病毒,只含有重組蛋白,因此稱為「無病毒中和性抗體檢測套組」。原理是在 ELISA plate 預先吸附 ACE2 蛋白,實驗樣本先和 HRP-RBD (SARS-CoV-2 RBD) 反應,再一起加入 ELISA plate 反應,最後以 TMB 呈色 (圖一)。如果樣本中沒有中和性抗體,則 HRP-RBD 會結合 ACE2,進而呈色。反之,若樣本中有中和性抗體,則吸光值降低。套組中附上 positive control 和 negative control,若樣本吸光值小於0.8倍 negative control,則此樣本定義成「有中和性抗體」。

表一:兩種檢測中和性抗體之方法比較

無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 操作上更快速,只需要1-2小時,且由於只需要蛋白質,因此批次間品質較穩定,價格也更便宜,適合大量樣本的檢測。相反地,假病毒實驗 (Pseudovirus assay) 由於要製作病毒,因此需要花費數天的時間,且批次間品質比較不穩定,價格也較高。
類別 無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 假病毒實驗 (Pseudovirus assay)
原理 HRP-RBD 蛋白有無結合 ACE2 蛋白 活的病毒送冷光基因進入細胞
穩定性 批次間較穩定 較不穩定
安全性 安全 危險
價格 便宜 較貴
操作 1-2小時 數天
應用 大量樣本檢測 1-10個樣本檢測


圖一:傳統病毒法 (cVNT, conventional virus neutralization test) 和無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT, Surrogate virus neutralization test) 原理比較。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 1]


產品應用
1. 群體免疫研究 (Herd immunity):
用於流行病學調查分析,有不同分析層面。
(1) 針對新冠病毒患者,於治療期間可當作死亡率判斷之參考,如果病患體內出現中和性抗體,代表產生有效的體液免疫,能夠抑制新冠病毒的感染和擴散,因此康復的機率較高。
(2) 針對曾經遭受新冠病毒感染並康復的患者,判斷此病患再次感染的機會,若有中和性抗體,則代表可以抑制病毒感染,再次感染的機會較低。
(3) 收集大量樣本,判斷是否有「無症狀」感染者,無症狀感染者如果康復,不容易以 qPCR 檢測病毒的存在,因此必須檢測血清中的抗體。而根據文獻中資料顯示,新冠病毒感染者體內的結合性抗體會隨著時間而有大幅度減少,相反地中和性抗體只會些微減少,因此檢測中和性抗體的靈敏度較高 (圖二)。



圖二:以 ELISA (左圖) 和假病毒實驗 (右圖) 分析37個無症狀感染者 (asymptomatic) 和37個有症狀感染者 (symptomatic) 的血清樣本。比較受測者於 Acute phase (qPCR 檢測 positive) 和 Convalescent phase (qPCR 檢測 negative,出院8週後) 的抗體含量。ELISA 結果顯示抗體含量下降70%以上,而中和性抗體下降幅度約為10%。代表以長期追蹤而言,檢測中和性抗體會具有較高的靈敏度。資料出處:Long, Q., Tang, X., Shi, Q. et al. Clinical and immunological assessment of asymptomatic SARS-CoV-2 infections. Nat Med 26, 1200–1204 (2020). [Fig. 3]

2.疫苗開發:
疫苗除了要能夠誘發人體產生體液免疫,還必須要產生中和性抗體,才能夠有效地抑制病毒的感染。因此,此套組可以作為疫苗開發中動物到臨床實驗中的確效,確保疫苗能誘發人體產生中和性抗體。

3.抗體藥篩選:
由於此套組可以適用於所有物種,因此,此套組適合應用於抗體藥開發中前期大量候選抗體的篩選,高通量且快速地篩選出合適的抗體。




產品優點
1.不含病毒,操作更方便、更安全、更快速,品質更穩定:
假病毒法 (pseudovirus) 需要有熟悉的技術和符合規定的實驗室 (BSL2),且需要數天的時間製備病毒,批次間製備的病毒品質不容易保證。而此套組只含有蛋白質,因此可在一般的實驗室進行,操作更方便、安全又快速,且批次間品質非常穩定 (intra CV & inter CV <10%) (表一)。

2.檢測中和性抗體,ELISA 只能檢測結合性抗體:
如同前面所述,此套組更能有效地評估抗體的功能,唯有中和性抗體能夠阻擋病毒的感染。市面上的 ELISA 是透過 Coating RBD,偵測樣本中的抗體,因此只能偵測到結合性抗體,判斷受測者是否有遭受感染,而無法判別其免疫的能力 (圖三)。


圖三:四個人類的血清樣本以 ELISA (左圖) 和無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) (右圖) 檢測,結果顯示雖然四個樣本中皆含有結合性抗體 (左圖),但是卻只有兩個樣本具有中和性抗體 (右圖),代表只有這兩個樣本具有抑制病毒感染細胞的能力,也代表 ELISA 無法辦別結合性和中和性抗體。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Extended Data Fig. 2]

3. 一次檢測所有 isotype 抗體,市面上 ELISA 只能偵測 IgG 或 IgM:
ELISA 是透過 HRP 鍵結的 anti-human antibody 抗體 (二抗) 來偵測樣本中的人類抗體,因此只能偵測 IgG 或 IgM。相反地,無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 是檢測抗體有無抑制 RBD 和 ACE2 的結合,因此可以偵測所有的 isotype (圖四)。



圖四:22個人類血清以 ELISA 分析 IgG 和 IgM 含量,並分成四組 high IgM/low IgG (n = 5), low IgM/low IgG (n = 9), low IgM/high IgG (n = 3), high IgM/high IgG (n = 5),並分別以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測。結果顯示即使 IgM 和 IgG 含量都很低 (low IgM/low IgG),依然具有明顯的中和效果。推測原因有兩個,一個是樣本中含有其他 isotype 抗體 (如 IgA, IgD, IgE),另一個原因是抗體透過其他機制抑制 RBD 和 ACE2 的結合 (例如:結合 RBD 蛋白質上 ACE2 結合位以外的部分,造成 RBD 構形改變,而導致 RBD 無法結合 ACE2)。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 2]

4.可偵測所有物種的抗體,市面上 ELISA 只能針對 Human:
ELISA 是透過 HRP 鍵結的 anti-human antibody 抗體 (二抗) 來偵測樣本中的人類抗體,因此只能偵測人類的抗體,無法偵測其他物種。相反地,無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 不限物種,只要抗體能夠抑制 RBD 和 ACE2 的結合,就會導致吸光值降低,因此可應用於疫苗或抗體藥開發前期的動物實驗 (圖五)。


圖五:四個兔子血清 (三個以新冠病毒 RBD 免疫) 和四個小鼠血清 (三個以新冠病毒 RBD 免疫) 以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測,結果證明此套組可以應用於動物實驗。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 3]

5.專一性高,對其他冠狀病毒反應低:
此套組具有足夠的專一性,除了 SARS RBD 結構相似度較高而有些微反應之外,Human coronavirus OC43, Human coronavirus 229E, MERS-CoV (alpaca) 皆沒有反應 (圖六、表二)。


圖六:以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測不同冠狀病毒感染的病患血清,包括 SARS-CoV-2 (n=10), SARS CoV (sampled in 2003, n=7, <1 year), SARS CoV (sampled in 2020, n=10, >17 years), human coronavirus OC43 (n=8), human coronavirus (n=10), MERS-CoV (alpaca) (n = 4)。除了 SARS-CoV 有些微反應之外,其他三種冠狀病毒皆無反應。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 3]

表二:專一性高,對其他冠狀病毒反應低
以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測不同冠狀病毒感染的病患血清,病毒包括 SARS-CoV (n=2), human coronavirus OC43 (n=2), human coronavirus 229E (n=2), Dengue virus (n=3), Zika virus (n=1), MERS-CoV (alpaca) (n=2), Influenza A/B (n=11), HCV (n=5), ANA (n=5), RSV (n=7), HBV (n=10), HIV (n=10)。除了 SARS-CoV 有些微反應之外 (False positive=2),其他病毒皆無反應。資料出處:Genscript 原廠內部測試。
sVNT test Sample (n=60) (sVNT)
False positive 2
Negative 58
Specificity 96.7%


6.以實際病人檢體確效過專一性 (specificity) 和靈敏度 (sensitivity):
以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測新冠病毒感染的臨床病患血清,證明其具有高專一性和高靈敏度 (圖七、表三)。


圖七:以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測新冠病毒感染的臨床病患血清,195血清來自於 Singapore,COVID-19 (n=175), Control (n=20);250血清來自於 China,COVID-19 (n=50), Control (n=200)。專一性皆為100%,而靈敏度亦超過98%。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 4]。

表三:以實際病人檢體確效過專一性 (specificity) 和靈敏度 (sensitivity)
以無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 檢測新冠病毒感染的臨床病患血清,樣本來自於 China, Singapore, US。資料出處:Genscript 原廠內部測試。
sVNT test Positive (n=193) Negative (n=480)
Positive 181 3
Negative 12 477
Sensitivity 93.80% --
Specificity -- 99.40%


7.和傳統病毒法相關性高:
傳統上是用真的病毒做中和性抗體測試,為了安全後來更換成假病毒 (pseudovirus),而無病毒中和性抗體檢測套組 (sVNT) 除了更安全之外,和傳統病毒法的相關性比假病毒高,因此更適合用來取代傳統病毒法 (圖八)。


圖八:60個 SARS-CoV-2 感染的病患血清同時以三種方法分析中和性抗體的多寡,並比較 sVNT (Surrogate virus neutralization test) 和 pVNT (Pseudovirus neutralization test) 對 cVNT (Conventional virus  neutralization test) 的相關性。sVNT 和 pVNT 以 log IC50 表示,cVNT 以 log neutralization titer 表示。由線性迴歸分析結果可以看出,和 pVNT 相比,sVNT 對 cVNT 具有較高的相關性 (R2 較高),代表 sVNT 比較能模擬真實病毒感染的情況,更有效地檢測中和性抗體。資料出處:Tan, C.W., Chia, W.N., Qin, X. et al. Nat Biotechnol (2020). [Fig. 4]。



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貨號 產品名稱 包裝
L00847 SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test Kit 1 kit (96T)
*此產品僅供科學研究用 (For research use only),另有 IVD kit (經歐盟、新加坡認證),歡迎來電洽詢。